Оглавление
- . Биохимические свойства и тест на уреазу (ключевой диагностический признак)
- Подготовка среды
- Засев
- Инкубация
- Учёт результата
- Тест-системы для биохимической идентификации криптококков
- API 20C AUX (bioMérieux)
- ID 32C (bioMérieux)
- Auxacolor / Auxacolor 2 (Bio-Rad)
- Integral System Yeasts Plus (Liofilchem)
- VITEK 2 YST (bioMérieux)
- . Биохимические свойства и тест на уреазу (ключевой диагностический признак)
- Идентификация криптококков методом MALDI-TOF MS
- Определение чувствительности криптококков к антимикотикам
Биохимические свойства и тест на уреазу (ключевой диагностический признак)
Биохимические свойства играют вспомогательную, но важную роль в лабораторной диагностике криптококков, особенно на этапе подтверждения принадлежности изолята к дрожжевым грибам и его дальнейшей идентификации. Для криптококков характерны следующие признаки:
- отсутствие ферментации сахаров
- способность к ассимиляции углеводов (глюкоза, галактоза, мальтоза, сахароза, инозитол)
- выраженная уреазная активность (гидролиз мочевины)
👉 Именно уреазная активность является одним из ключевых диагностических признаков криптококков.
С практической точки зрения это критически важно:
- большинство грибов рода Candida — уреаза-отрицательны
- криптококки — уреаза-положительны
👉 Таким образом, тест на уреазу — это простой и быстрый способ дифференцировать криптококки от кандид на этапе первичной идентификации.
Алгоритм выполнения уреазного теста (среда с мочевиной)
Для определения уреазной активности используется среда, содержащая мочевину и pH-индикатор (чаще всего феноловый красный).
Принцип метода
Криптококки гидролизуют мочевину с образованием аммиака, что приводит к защелачиванию среды и изменению её окраски.
Пошаговый алгоритм
- Подготовка среды
- используют готовую уреазную среду (например, бульон Кристенсена)
- или лабораторно приготовленную среду с мочевиной
- Засев
- берут чистую культуру дрожжевого гриба
- выполняют штриховой посев на поверхность среды или помещают 1 петлю с культурой в бульон
- желательно параллельно засевать контрольные пробирки – заведомо положительный и заведомо отрицательный виды грибов
- Инкубация
- температура: 25–30 °C (допустимо 35–37 °C)
- срок: от 24 часов до 3–5 суток
- Учёт результата
Положительная реакция (уреаза +):
- изменение цвета среды (обычно с жёлтого/оранжевого на розовый/малиновый)
- признак гидролиза мочевины
Отрицательная реакция (уреаза −):
- цвет среды не изменяется
Интерпретация
- уреаза + → в первую очередь думать о криптококках
- уреаза − → вероятнее Candida spp.
Практический комментарий
- тест прост, дешёв и быстро выполняется
- может быть выполнен в любой лаборатории
- резко повышает точность первичной идентификации
👉 При наличии дрожжевого роста и отсутствии уреазного теста диагностика криптококков считается неполной.
2.2. CGB-агар (canavanine-glycine-bromthymol blue agar)
Для дифференциации патогенных видов криптококков используется: CGB-агар Данная среда позволяет различать Cryptococcus neoformans и Cryptococcus gattii. Принцип:
- C. gattii изменяет цвет среды на синий
- C. neoformans не вызывает изменения окраски
Таким образом, CGB-агар является простым и наглядным инструментом видовой дифференциации криптококков в лаборатории
2.3. Дополнительные среды
В ряде случаев могут использоваться и другие специализированные среды, например:
- CDBT-агар (creatinine dextrose bromthymol blue thymine)
Однако в практической работе наибольшее значение имеют именно Bird Seed Agar и CGB-агар как наиболее информативные и доступные методы дифференциации.
Практический алгоритм культуральной диагностики криптококков
На практике ключевым является не наличие отдельных тестов, а правильная последовательность их применения. Ниже приведён рабочий алгоритм, который может использоваться в рутинной лаборатории.
Этап 1. Первичный посев Материал (ликвор, кровь, БАЛ и др.) засевают на:
- агар Сабуро с хлорамфениколом
- (при возможности сразу) Bird Seed Agar
Цель: получение роста, первичная оценка морфологии
Этап 2. Изучение свойств колоний При появлении роста обращают внимание на:
- дрожжеподобный характер колоний
- гладкую и блестящую поверхность
👉 На этом этапе идентификация невозможна, только подозрение.
Этап 3. Проверка на криптококки При подозрении на дрожжевые грибы:
- выполняют микроскопию культуры
- проводят окраску Indian ink
- Цель: выявление капсулы
- подтверждение принадлежности к криптококкам – круглые почкующиеся клетки с узкими перешейками.
Этап 4. Использование дифференциальных сред Далее подключаются специализированные среды:
- Bird Seed Agar → пигментация (скрининг криптококков)
- CGB-агар → дифференциация C. neoformans / C. gattii
Подготовка ликвора
Подготовка ликвора при подозрении на криптококковую инфекцию должна быть максимально щадящей, так как материал изначально содержит небольшое количество клеток, и любые лишние манипуляции могут снизить диагностическую чувствительность.
- Исследование начинают с нативного ликвора: каплю материала наносят на предметное стекло и сразу используют для микроскопии, в первую очередь с добавлением туши (India ink) для выявления капсулы криптококков.
- При низкой клеточной нагрузке ликвор предварительно центрифугируют (обычно 1500–3000 g в течение 10–15 минут) и исследуют осадок, из которого готовят нативные и окрашенные препараты.
- Важно, что посев на питательные среды выполняют параллельно с микроскопией, без задержек.
Таким образом, ключевыми принципами являются минимальная обработка материала, быстрое проведение исследования и приоритет выявления капсулы как основного диагностического признака криптококков.
